繼上(shàng)文(wén)對(duì)基因工(gō≤↑ng)程抗體(tǐ)相(xiàng)關情況進行(xíng)✔↕ 闡述後，本文(wén)接著(zhe)對(duì)抗體 ∏≥(tǐ)藥物(wù)的(de)大(dà)規≤"≠模制(zhì)備與分(fēn)離(lí)純化(huà)以及§♣"抗體(tǐ)的(de)作(zuò)用(yòng)機(jī)制(zhì)★¶進行(xíng)論述。

抗體(tǐ)大(dà)規模制(zhì)備π≠ ∞和(hé)純化(huà)是(shì)抗體(tǐ)藥物(wùα←✔)生(shēng)産的(de)關鍵技(jì)術(shù)，是(shì)抗體(t©>ǐ)藥物(wù)産業(yè)化(huà)轉化(huà)的 ©÷(de)重要(yào)環節，目前國(guó)際上(shàng)抗體(tǐββ)生(shēng)産在中試規模産量達到(dào)5g/'←γλL以上(shàng)，商業(yè)化(huà)生(shē λng)産反應器(qì)規模達到(dào)↕<♣20000L，單批次純化(huà)抗體(tǐ)産量超過2€÷$0kg，遠(yuǎn)高(gāo)于國(guó)內€¶✔(nèi)水(shuǐ)平。抗體(tǐ)✘♥Ω生(shēng)産工(gōng)藝技(jì)術(shù)在過去(qù)三十‍©™€多(duō)年(nián)裡(lǐ)得(de)到(dào)β★ Ω了(le)迅猛的(de)發展（20世紀80年(nián)代初的(de'∞)單抗藥物(wù)剛起步時(shí)，每升抗體(tǐ)産量隻有(yǒ‌↕✘u)10mg），主要(yào)體(tǐ)現(xiàn)在3個₽±♦≥(gè)方面：1）抗體(tǐ)表達水(shuǐ)平大(dà)大(dà)提高(α₽≈<gāo)，生(shēng)産成本大(dà)幅降低(dī$ ←✘)；2）生(shēng)産工(gōng)藝安全性和(hé)穩定性↔←∞®大(dà)幅提高(gāo)；3）工(gōng)藝放(fà"'$ng)大(dà)和(hé)大(dà)規模哺乳動物(←‍♣₹wù)細胞培養經驗日(rì)漸豐富。

抗體(tǐ)的(de)成功大(dà)規模生(shēng)産始于高(gāo)§π∞水(shuǐ)平的(de)工(gōng)藝開(≈↕kāi)發，好(hǎo)的(de)工(gōng)藝開(kāi)發需同時(₹δshí)具備高(gāo)表達（決定了(le)工(gō≤↕ng)藝的(de)經濟性）、高(gāo)穩定性（來(lái)源于對(d☆$uì)細胞株和(hé)工(gōng)藝的(de)深€≠刻理(lǐ)解）和(hé)可(kě)放(fàng)大(dà)性3個(gè±×★)優點。同時(shí)工(gōng)藝放(fàng)大(dà)對(du≤≈€ì)抗體(tǐ)藥物(wù)大(dà)規模的(de)制(zhì)備也(yě)很π₩≤∑(hěn)重要(yào)，成功的(de)←¥↕工(gōng)藝放(fàng)大(dà)是(shì)§×☆≤對(duì)産品質量（首要(yào)考慮）、産率和(hé)細胞活率的≈∏↓(de)影(yǐng)響降到(dào)最低(dī)。

大(dà)規模哺乳動物(wù)細胞培養是(shì)重組蛋白(bái)"λ'和(hé)抗體(tǐ)藥物(wù)生(shēng)産的(de)主要(yào​&•δ)平台技(jì)術(shù)。懸浮細胞培養是(shì)上(shàng)市(α¥‍shì)抗體(tǐ)藥物(wù)生(shēng)産工(gōng)藝的(de♥π≤)共同選擇。懸浮細胞培養操作(zuò)簡單，手工(gōng♦♥)操作(zuò)少(shǎo)，易放(fàng)"♦δ$大(dà)，還(hái)可(kě)借鑒傳統發酵工(gōng)藝積累的(de)↕ε♥大(dà)量經驗。相(xiàng)比細菌、酵母等表達系統，哺乳動物(wù)細胞≥÷σ是(shì)一(yī)個(gè)低(dī)♣↕>¶效率的(de)蛋白(bái)表達系統，要 α(yào)提高(gāo)抗體(tǐ)生(shēn≤•‍$g)成效率主要(yào)可(kě)通(tōφ¶λ‍ng)過兩方面實現(xiàn)：提高(gāo)生(σ₹↔♠shēng)産工(gōng)藝的(de)細胞密度和(h ✔é)增加單個(gè)細胞的(de)表達效率。

培養基是(shì)細胞培養和(hé)抗體(tǐ)生(shēng)産的(de)核≤€‌心，提供了(le)細胞生(shēng)長(cháng)的(de)環境。細胞最↕♠主要(yào)的(de)能(néng)量來(lái)源是(shì)葡萄"©糖和(hé)谷氨酰胺，氨基酸主要(yào)用(yòng)于合成蛋白(bái)質≠↔★和(hé)核酸。培養基中一(yī)般包括所有(yǒu)20種氨基酸，一(‌>ε↕yī)方面提高(gāo)工(gōng)藝的↔≠©δ(de)穩定性，另一(yī)方面可(kě)減輕細胞的(de)代謝(xiè)壓£€≥力。種子(zǐ)擴增，起于細胞複蘇，止于生(shēng)産反應器(q♥ε✔δì)的(de)接種。種子(zǐ)擴增的(de)目的(de)≥ σβ是(shì)通(tōng)過一(yī)系列不(bù)同×α體(tǐ)積和(hé)不(bù)同類型的(de)細胞培• ♠養裝置，不(bù)斷加大(dà)細胞培養體(tǐ)積，為(wèi)​±​←抗體(tǐ)生(shēng)産獲得(de)足夠的(de)細胞。σ∏單抗生(shēng)産工(gōng)藝的(de)開(kāi)發主要×πβ↕(yào)集中在4方面—&mda♠π  sh;宿主細胞、表達載體(tǐ)、反應器(qì)操作(zu§‍ò)和(hé)培養工(gōng)藝，決定了(le)最"∞"終工(gōng)藝及産品的(de)效率和(hé∏&)質量。

大(dà)規模抗體(tǐ)生(shēng)成主要(yào)是(shì→¶★)利用(yòng)流加工(gōng)藝和(hé)灌注工(gōng↑™♣♠)藝。流加工(gōng)藝較灌注工(gōng)藝有(& ÷ yǒu)3個(gè)優點——可×¥&‍(kě)靠性高(gāo)、易放(fàng)大(dà)和(hé)生(shēng)♣§産成本低(dī)。流加工(gōng)藝操作(zuò≤→Ω)簡單，應用(yòng)靈活，易于放(fàng)大(dà)，已成為(w♥ε€λèi)國(guó)際抗體(tǐ)商業(yè)化(huà)生(shēng)産的≥Ω™(de)主要(yào)平台技(jì)術(shù♦★)，多(duō)家(jiā)制(zhì)←♣藥企業(yè)已成功實現(xiàn)10000L到(dào)2500∑∏β'0L的(de)大(dà)規模抗體(tǐ)生(shēng)産。流加♠≈÷®工(gōng)藝開(kāi)發和(hé)優化(huà)的(de)'∞♠重點就(jiù)是(shì)加料的(de§×≠)平衡和(hé)代謝(xiè)副産物(wù)的(≈✔®↓de)抑制(zhì)。灌注工(gōng)藝較流加工©♠(gōng)藝也(yě)有(yǒu)3個(gè)主要(yào)優點&mdas✔< h;—細胞生(shēng)長(cháα↕ng)環境更佳、适合生(shēng)産已降解的(de)産品和(hé)細胞密度>'γ≤更高(gāo)。灌注工(gōng)藝的(de)重點是(shì)細胞分(f±♣ēn)離(lí)裝置和(hé)培養基的(×≤‍→de)優化(huà)。分(fēn)離(lí)裝置可(kě)将大(dφ♥à)部分(fēn)細胞截流在反應器(qì)中，是(shì)實現(xiàn)灌注✘₽≤換液和(hé)提高(gāo)細胞密度的(de)÷>關鍵。灌注工(gōng)藝因細胞分(fēn)離(líεδ÷≥)裝置的(de)限制(zhì)，主要(yào)用(yòng)φε于2000L及以下(xià)規模。

細胞反應器(qì)自(zì)重組蛋白(bái)藥物φ©'(wù)剛起步就(jiù)湧現(xiàn)出>←₽了(le)一(yī)批，但(dàn)随著(zhe)實踐的(de₽γ)深入，最簡單的(de)罐式攪拌反應器(qì)成為(wèi)大(d'↑à)規模細胞培養采用(yòng)的(de)主流反應器(qì)類÷₹ 型。罐式攪拌反應器(qì)具有(yǒu)1） '結構簡單，操作(zuò)方便，清洗容易；2）細胞生(shēng)長(chángε×σ‌)環境均一(yī)性好(hǎo)；3）細胞保持懸浮；4）易←επ€放(fàng)大(dà)；5）傳氧方式簡單；6）大(dà&Ω↑δ)量發酵罐操作(zuò)經驗可(kě)以借鑒等優點。罐式反應器<ε​(qì)應用(yòng)的(de)最大(dà)挑戰來(l‍ ✔ái)自(zì)攪拌和(hé)鼓泡帶來(lái)的(de)高(gāo)剪切βφ力，可(kě)通(tōng)過攪拌速度、鼓泡方式、氣泡大(dà)小(xi÷'ǎo)的(de)控制(zhì)，以及添加細胞保護劑等來(lái)解決。

細胞培養的(de)工(gōng)藝放(fàng)大(dà)是(shì)抗體(tφ☆<'ǐ)大(dà)規模生(shēng)産的(de)一(yī)個(‌§gè)關鍵技(jì)術(shù)，是(shì)成功進行(xíng)中試生(≤∑£shēng)産及商業(yè)化(huà)生(shēng)産的(de" β€)必要(yào)條件(jiàn)。目前還(hái)沒有(yǒu)成熟的(de©→σ)指導原則，更多(duō)的(de)是(shì)依靠經驗♣≈和(hé)逐級放(fàng)大(dà)的(de)摸索。☆&細胞培養工(gōng)藝放(fàng)大(dà)難度的(de)根本γ±♦↕原因在于哺乳動物(wù)細胞對(duì)剪切力的(de)高(gāo) ™敏感性。在工(gōng)藝放(fàng)大(dà)中£↑£，工(gōng)藝參數(shù)（包括與放(f♣ £≤àng)大(dà)無關的(de)參數(sγ‌hù)）影(yǐng)響較小(xiǎo)，操作(÷‌λδzuò)參數(shù)（與放(fàng)大(dà)直接相(xià≈✔£ng)關的(de)參數(shù)，包括攪拌速率、鼓泡速度、堿液添加速度等）是"≥♥(shì)工(gōng)藝放(fàng)大(d₩δ ×à)的(de)重點。反應器(qì)放(fàng)大(dà)後攪拌速率的ε∑±♥(de)确定是(shì)工(gōng)藝放(fàng)大(dà↓ε&)最重要(yào)的(de)一(yī)個(g&‍✔×è)環節。轉速越高(gāo)，剪切力越大(dà)。反應✘Ωδ♦器(qì)在放(fàng)大(dà)後應盡量控制(★β₩zhì)剪切力，避免高(gāo)剪切力帶來(lái)的σ♦©(de)細胞和(hé)抗體(tǐ)産品質量變化(huà)。但(dàn)ε≥ €為(wèi)避免均一(yī)性降低(dī)帶來(lái)的(de& ←★)負面影(yǐng)響，在細胞耐受的(de)情況下(≤↕xià)，大(dà)型反應器(qì)的(de)攪拌&<強度也(yě)應盡量提高(gāo)。

抗體(tǐ)分(fēn)離(lí)純化(hu♠<à)的(de)主要(yào)目的(de)©≈是(shì)将抗體(tǐ)與工(gōng)藝相(xi"©àng)關雜(zá)質和(hé)産品相(xiàng)關雜(zá)質分(fēn≥₹₹¶)離(lí)，最終獲得(de)高(gāo)純度、低(dī)潛在危α'害的(de)抗體(tǐ)藥物(wù)。純化(h♣ε•★uà)過程中需要(yào)去(qù)除的(¶λde)工(gōng)藝相(xiàng)關雜(zá)質包Ω♣↔✘括細胞、細胞碎片、宿主細胞蛋白(bái)、宿主細胞₽•核酸及培養基與加料液成分(fēn)，需去(qù)除的(de)産品相(xiàn♣♠₽βg)關雜(zá)質主要(yào)包括抗體(tǐ)片段和(h®★é)聚集體(tǐ)。純化(huà)過程還(hái)需具備足夠的(de)病毒滅×'活去(qù)除能(néng)力，以去(qù)"​除宿主細胞自(zì)身(shēn)表達的(de)內(nèi)源病毒樣顆粒±$和(hé)未及時(shí)發現(xiàn)β©的(de)外(wài)源病毒。抗體(tǐβ≈✘)分(fēn)子(zǐ)由于結構和(hé)物(wù)理≤™¶Ω(lǐ)化(huà)學性質上(shàng×₽δ)的(de)相(xiàng)似，其分(fēn)離(lí)工(gōng)藝大(✘‌dà)緻相(xiàng)同，多(duō)為(wèi)利φ≥φ&用(yòng)蛋白(bái)A來(lái)捕獲抗體(tǐγ↑)，并利用(yòng)了(le)至少(shǎo)1個(gè)離(lí)子(z $β★ǐ)交換層析作(zuò)為(wèi)精純步驟。一(yī)個(g&∞‌è)典型的(de)抗體(tǐ)純化(huà)工(gōng)藝為(wèi)：離♣​<✘(lí)心、過濾——蛋白(bá↕₹σ₹i)A層析——低(dī)PH孵育 γ•↓——陰離(lí)子(zǐ)層析—&md∞λ≈ ash;陽離(lí)子(zǐ)層析&mdash>β≤¶;—病毒過濾——€♦UF/DF。随著(zhe)技(jì)術(shù)的(de✔‍π®)進步，大(dà)規模生(shēng)産" ®抗體(tǐ)瓶頸從(cóng)抗體(tǐ)表達轉移到←≠¶₽(dào)了(le)抗體(tǐ)純化(huà)。

純化(huà)的(de)第一(yī)步是(sδ§×hì)将培養液上(shàng)清與細胞及細胞碎片分(fēn)離(lí Ω)開(kāi)來(lái)，大(dà)規模抗體(tǐ)生(shēn≤'g)産主要(yào)采用(yòng)連續分(fēn)離(lí)₽​的(de)方法。蛋白(bái)A是(shì)一(yī)★Ωε☆個(gè)金(jīn)黃(huáng)色葡萄 ™Ω&球菌胞壁蛋白(bái)，對(duì)抗體(tǐ)純化(h£δuà)有(yǒu)很(hěn)好(hǎo)的(de)β 通(tōng)用(yòng)性，能(néng)去(q¶•←ù)除培養上(shàng)清中大(dà)部分(fē•≥¶n)雜(zá)質。蛋白(bái)A親和(hé)層析工(gōn₩¥g)藝開(kāi)發和(hé)優化(huà≈®)的(de)重點是(shì)抗體(tǐ)載量、停留時(↓± ∏shí)間(jiān)（流速）、淋洗和(hé)洗₽±脫條件(jiàn)。抗體(tǐ)捕獲後，還(hái)需進一(yī)步精純，一γ÷¥¶(yī)般采用(yòng)兩步層析以保持足夠的(de)純化(huà)冗餘。現(αβ ≈xiàn)在越來(lái)越多(duō)的(de)公司也(yě•'←→)開(kāi)始采用(yòng)一(yī)步精純來(lái)提高§"(gāo)收率和(hé)純化(huà)速度，降低δ<(dī)成本。純化(huà)的(de)另一(yī)個(gè)重要 ∏♠₩(yào)目的(de)是(shì)有(yǒu)效去(qù)除滅活收料液中的‍ε±"(de)內(nèi)源逆轉錄病毒樣顆粒，以及未檢測到(dào)的(de)外(₹©wài)源病毒。病毒滅活步驟主要(yào)包括低(dī)PH孵Ωφ™β育和(hé)病毒過濾。

在可(kě)預見(jiàn)的(de)将來(→∏$‍lái)，抗體(tǐ)生(shēng)成還(hái)将保持現(xiàn)≤α$有(yǒu)的(de)工(gōng)藝路(lù)線，但(dànπ™)工(gōng)藝的(de)效率、通(tōng)量會(huì)進一(y↓↓↑₽ī)步增加，成本會(huì)進一(yī)步降低(dī)。再過幾年(α₩βnián)，我國(guó)包括抗體(tǐ)÷£★生(shēng)産工(gōng)藝開(kāi)發和(hé)工(gōng)藝↑'∏€放(fàng)大(dà)在內(nèi)的(de)全套關鍵技(jì)術(s↑± hù)會(huì)逐步提高(gāo)到(dào)國(guó)際先進水(shu∏↓‌ǐ)平。

任何化(huà)合物(wù)分(fēn)子(zǐ'σ÷)的(de)功能(néng)都(dōu)是(shì)由其結 ∏ ₹構決定的(de)，單抗也(yě)是(shìλ₽)這(zhè)樣。單抗由抗原結合部位（Fab）和(hé)可(kě)β≥÷結晶部位（Fc）構成一(yī)個(gè)Y& 形結構。其中，Fab識别結合抗原靶标，決定單抗¶®γ±的(de)特異性和(hé)親和(hé)力；Fc結合表達于免疫效應細胞表≠₹β±面的(de)Fc受體(tǐ)，以及血液中的(de)補體(tǐ)和(hé)→§₩→清道(dào)夫受體(tǐ)（FcRn），決定了(le)單抗的(de)免疫效應" ε以及在機(jī)體(tǐ)內(nèi)的(de)半衰期。

抗體(tǐ)Fab相(xiàng)關作(zuòΩ∑♠≥)用(yòng)機(jī)制(zhì)由于抗原不(bù)同的(de)生(sh×✔ēng)理(lǐ)學機(jī)制(zhì)，可(kě)以分(fēn‍π׶)為(wèi)識别遊離(lí)分(fēn)子(zǐ)靶點的∑ε'(de)單抗和(hé)識别細胞表面受體(tǐ)的(de)單抗。1）識别遊離(l↑©₩"í)分(fēn)子(zǐ)靶點的(de)單抗。遊離(lí→¶)存在于血液循環中的(de)細胞因子(zǐ)、生(shēng)長(cháng)∏♠ε∑因子(zǐ)、生(shēng)物(wù)毒素以♠±及人(rén)侵的(de)病毒等，都(dōu)可(kě)以作(z♠¶★Ωuò)為(wèi)單抗的(de)作(zuò)用(yòng)靶點σ☆。中和(hé)抗體(tǐ)的(de)作(zuò)用(yòng)機♦≈•(jī)制(zhì)是(shì)通(tōn≠∞g)過結合抗原進行(xíng)中和(hé)，使抗原喪失結合♦φβ受體(tǐ)的(de)能(néng)力，進而喪失生(shēng)物↕✔↕∏(wù)學功能(néng)。2）識别細胞表面受體(↑€÷tǐ)的(de)單抗。靶點抗原表達在特定≠ ∞÷細胞表面，具有(yǒu)特定功能(néng)，例如↕≤(rú)細胞激活、生(shēng)長(cháng)或遷©δ↕¥移。抗體(tǐ)可(kě)通(tōng)過結合、拮抗和(hé)激活的÷☆→(de)方式與靶受體(tǐ)相(xiàng)≠¶互作(zuò)用(yòng)。抗體(tǐ)的(≠ →‍de)Fc部位決定了(le)抗體(tǐ)的(de)效應功能(néng)，包括抗>¶™體(tǐ)依賴細胞毒作(zuò)用(yòng)（ADCC）和(hé)♦&補體(tǐ)依賴細胞毒作(zuò)用(yòng)§ €δ（CDC）。此外(wài)，單抗還(hái)具有(yǒu)類似疫♦ 苗的(de)功能(néng)，能(néng)激發獲得(de)性¶₽φ✘免疫反應，使機(jī)體(tǐ)獲得(de)針對(duì)腫瘤抗原的<₩(de)免疫性。對(duì)抗體(tǐ)機(jī)制(zhì)的(de'" £)了(le)解，有(yǒu)助于投資者對(duì)抗←∞體(tǐ)治療方案優劣和(hé)具體(tǐ)抗體(tǐ)前景的(≠÷↕de)分(fēn)析。不(bù)同抗體(tǐ)的(de)作(zuò)用(yò<§₽∞ng)過程就(jiù)好(hǎo)比一(yī)場(chǎng)&&>₩ldquo;戰争”，期間(jiān)的(de)排兵(bīng ​)布陣、敵我态勢的(de)變化(huà)非常有(yǒu) ← ×趣，有(yǒu)時(shí)間(jiān)可(kě)以私聊。由♥♣于篇幅所限，在此就(jiù)不(bù)再一(yī)一(y≈×→ī)展開(kāi)論述具體(tǐ)的(de)作αβ✘(zuò)用(yòng)機(jī)制(zhì)是(shì)如(rú)何的(dΩ→φ¶e)了(le)。

圖表一(yī)：單抗的(de)作(zuò)σ≥用(yòng)機(jī)制(zhì)

    至此，抗體(tǐ)藥物(wù)基本技(jì)術§✔•(shù)就(jiù)已基本介紹完畢，接下(xià)來(lái)會(huì ¥)談談抗體(tǐ)藥物(wù)應用(yòng)技(jì)術(shù)等方面 ♦的(de)內(nèi)容，敬請(qǐng)期待。

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